Técnicas de Microscopía

Un aspecto muy importante a la par que descuidado de la observación microscópica, es obtener una iluminación apropiada de la muestra.

Para las fotografías que realizo para nuestra web he utilizado la llamada iluminación de Köhler, con ella obtenemos una iluminación apropiada que nos permite obtener la mayor cantidad de detalles de cada preparación.

Aunque no es difícil de conseguir, hay que tener cierto dominio de las diferentes partes de un microscopio óptico. Ya vimos en nuestro post que las podíamos clasificar en:

• Sistema mecánico que permite el enfoque de la muestra.
• Sistema óptico en forma de un conjunto de diversas lentes que permiten la ampliación.
• Sistema de iluminación formado por un emisor de luz y un conjunto de elementos que reflejan y conducen dicha luz hasta la muestra además de un regulador de la intensidad luminosa.

Hemos de tener en cuenta que en la iluminación van a intervenir varios factores. por un lado tendremos el contraste (ver fotografía 1) y la resolución, y por otro la intensidad luminosa (ver fotografía 2).

Fotografía 1 – Modificación de la imagen inicial del post, con disminución (izquierda) y aumento del contraste (derecha).

Misma imagen que en la fotografía previa pero convertida a escala de grises; se aprecia mejor la diferencia de contrastes.

Fotografía 2 – Modificación de la imagen inicial donde solo se ha modificado el brillo de la misma. Disminuido a la izquierda y aumentado a la derecha.

Ahora bien, ¿cómo utilizamos esto para conseguir una buena iluminación?

1. Enfocamos la muestra como se explicó en el post previo.
2. Cerramos ambos diafragmas y, si el condensador no está ajustado, se observará un círculo luminoso de bordes poco definidos.
3. Hay que tener en cuenta que si ese círculo no aparece en el centro hemos de centrar el condensador (fotografía 3). Para ello usaremos los tornillos que aparecen en la fotografía 4. Lo usual es aflojar el que fija el condensador y usar los otros dos tornillos para mover el círculo luminoso hasta el centro. Una vez allí volvemos a apretar el tornillo de fijación.
4. Ahora hemos de ajustar la altura del condensador hasta conseguir que el círculo se convierta en un polígono de lados bien definidos (fotografía 5).

Fotografía 3 – Proceso de centrado del condensador.

Fotografía 4 – Se señalan algunos componentes del microscopio, entre ellos los tornillos para centrado del condensador.

Fotografía 5 – Proceso de ajuste de la altura del condensador. Aunque no se ve con claridad en la foto, a la derecha se puede intuir que el círculo difuminado ha pasado a tener bordes más bien poligonales.

Ahora ajustaremos ambos diafragmas para conseguir que la muestra esté iluminada de forma regular. Esto va a variar según el objetivo empleado, por lo que se describe a continuación tendrá que ser repetido cada vez que cambiemos de uno a otro.

Seguiremos dos pasos:

1. Usaremos el diafragma de campo para iluminar solamente la parte de la muestra que estamos observando. Si partimos de que lo teníamos cerrado, lo abrimos lentamente. Veremos como la porción iluminada (que tendrá borde hexagonal) se hace mayor. Hemos de detenernos cuando pasemos ligeramente el borde del campo observado (fotografía 6).
2. Ajustamos el diafragma del condensador para obtener la mejor relación contraste/resolución, pudiendo hacerlo de dos formas diferentes:
   • Una posibilidad es quitar uno de los oculares y observar el círculo luminoso que hay (fotografía 7). Abriremos el diafragma del condensador hasta que dicho círculo ocupe un 60-70% del total.
   • La otra implica abrirlo mientras observamos la muestra y obtener la relación contraste/resolución “a ojo” según lo que estemos observando.

Fotografía 6 – Ajuste de la apertura del diafragma de campo. Como el condensador está a la altura correcta se aprecia la forma poligonal del diafragma de campo. Lo abriremos hasta que ocupe todo el campo de observación.

Fotografía 7 – Ajuste de la apertura del diafragma del condensador: En la fotografía de la izquierda se aprecia cómo retiramos el ocular que no tiene ajuste de dioptrías. En la fotografía derecha se aprecia que en su lugar aparece un círculo luminoso, abriremos el diafragma hasta que ocupe un 60-70% del total.

Para acabar ajustamos la intensidad luminosa con su rueda correspondiente (fotografía 8).

Fotografía 8 – Se señalan algunos elementos del microscopio, entre ellos la rueda de ajuste de intensidad luminosa.

Y esto es todo. Si nos acostumbramos a realizar estos ajustes, con un poco de práctica se interiorizan con rapidez y nos facilitan la observación. Si aún queda alguna duda recomiendo echar un vistazo a este tutorial en la web de Leica o a vídeos en Youtube.

Jaime Ollero Gómez. R3 Bioquímica Clínica. CHUAC

Fotos realizadas en el laboratorio de Análisis Clínicos del CHUAC.

Cuando observamos por el microscopio muchos olvidan que hemos de ajustarlo correctamente si queremos sacar un rendimiento apropiado del mismo. No solo podremos perdernos algún detalle importante, sino que aumentará la fatiga visual si no tenemos en cuenta algunas cosas sencillas.

Para aquellos que tienen dificultad en entender el enfoque, a continuación añado una serie de imágenes de la misma muestra: desde la correctamente enfocada hasta la claramente desenfocada (hacer clic en cada imagen para ver ampliación).

Es evidente que la primera imagen aporta mucha más información que la última.

Para enfocar debemos:

1. Poner la muestra en la pletina.
2. Ajustar la distancia interpupilar (separación entre ambos oculares); ver fotografía 1.
3. Seleccionar el objetivo de mínimo aumento,
4. Con el tornillo macrométrico (fotografía 2) ajustamos la altura de la pletina hasta que la muestra esté enfocada.
5. Usamos el tornillo micrométrico para un ajuste fino. A partir de ahora, cuando cambiemos de objetivo, casi siempre con un ajuste micrométrico será suficiente.

Fotografía 1 – Escalas para el ajuste de la distancia interpupilar.

Fotografía 2 – Tornillos de enfoque.

No olvidar que en un microscopio binocular tendremos dos oculares. Uno de ellos suele ser fijo, el otro suele tener una pequeña rueda de ajuste con unos valores que suelen oscilar entre -2 y +2 (o simplemente suelen aparecer como un cero y una serie de marcas que van en un sentido negativo y otro positivo (ver fotografía 3). Esta rueda nos ayuda a compensar las dioptrías de diferencia que puede haber entre un ojo y otro; es imposible sacar un pleno rendimiento a la observación si no las ajustamos.

Por tanto, este paso es fundamental. No es la primera vez se escuchan quejas de fatiga ocular para descubrir que una persona con vista normal está observando con dos oculares desajustados, uno a cero y otro a -2.

Fotografía 3 – Obsérvese que en ambos microscopios uno de los oculares es ajustable, el otro no.

El procedimiento es muy sencillo:

1. Ponemos el ocular ajustable en cero, que es la posición neutra e idéntica al ocular fijo.
2. Mirando solo con el ojo del ocular fijo (cerramos el otro), enfocamos la muestra con el tornillo macrométrico.
3. Enfocamos la muestra con el micrométrico, de este modo habremos enfocado con el ocular fijo. cualquier diferencia de dioptrías entre ambos ojos las corregiremos a continuación.
4. Ahora cerramos el ojo del ocular fijo y miramos por el ajustable. ¿Se observa igual de bien? Entonces no hace falta ningún ajuste. ¿Vemos desenfocado? Entonces movemos la rueda de ajuste de dioptrías hasta que veamos en foco.

Si tuviéramos dos oculares ajustables, hemos de procurar que en el primer paso ambos estén en posición neutra. Luego elegimos uno de los dos que dejaremos como fijo fijo y procedemos con los pasos descritos.

Con todo esto ya estaremos en condiciones de seguir con el siguiente paso que vendrá en el próximo post, iluminar correctamente la muestra.

Jaime Ollero Gómez. R3 Bioquímica Clínica. CHUAC

Fotos realizadas en el laboratorio del CHUAC.

Para usar apropiadamente el microscopio óptico, primero hemos de conocer cuáles son las diferentes partes del mismo.

Desde su construcción por Leeuwenhoek, ya podemos constatar que los tres sistemas básicos están presentes:

• Óptico
• Mecánico
• Iluminación

Microscopio de Leeuwenhoek. 1, 2, 4. Sistema mecánico. 3. Lente.

El sistema óptico consiste en un conjunto de lentes para amplificar la imagen. Estas son:

• Oculares: Es la más próxima al ojo del observador, amplifica la imagen que producen los objetivos.
• Objetivos: es la pieza más próxima a la muestra, están situados en el revólver.

Oculares y objetivos

El sistema mecánico permite el movimiento de enfoque:

• Tornillos macro y micrométricos para ajustar la distancia del tubo óptico con la pletina y así poder lograr un enfoque apropiado.
• Revólver: es la pieza circular donde están situados los objetivos.

Tornillos o rueda de enfoque

El sistema de iluminación nos va a permitir lograr una adecuada iluminación de la muestra. Esto es una armonización entre resolución, intensidad luminosa y contraste. Tiene los siguientes elementos:

• Fuente luminosa: puede ser luz solar, una lámpara incandescente o una luz led. Podemos regular su intensidad.
• Espejo para dirigir la luz emitida por la fuente.
• Condensador: Tal y como dice Wikipedia, está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo. Con esto podremos ajustar el contraste y la resolución.
• Diafragmas: permiten o restringen el paso de luz. Usualmente hay uno en el condensador y otro bajo el, llamados respectivamente diafragmas del condensador y de campo.
• Linterna: en algunos microscopios.

Los dos diafragmas. A la izquierda el diafragma de campo, a la derecha el condensador donde se puede observar la rueda para regular la apertura del diafragma.

Microscopio de Hooke

Jaime Ollero Gómez. R3 Bioquímica Clínica. CHUAC

Fotos realizadas en el laboratorio del CHUAC.